چکیده
تعیین وضعیت جهش‌یافته بودن یا نبودن KRAS در نمونه‌های توموری اهمیت بنیادینی در مدیریت بیماران مبتلا به سرطان ریه یا سرطان روده‌ی بزرگ دارد؛ چرا که این جهش‌ها مانع درمان با آنتی‌بادی‌های مونوکلونال گیرنده‌های فاکتورهای رشد اپیدرمی (EGFR) می‌شوند. در این پژوهش، روش PCR کمّی مخصوص برای الل چندگانه، سریع و ارزان‌قیمتی را گزارش می‌دهیم که می‌تواند هفت جهش اصلی و مرتبط با مسائل بالینی در KRAS را شناسایی و همزمان، ژن‌های KRAS جهش‌نیافته را در سلول‌های توموری و بافت‌های بیماران سرطان روده‌ی بزرگ تکثیر کند. نمونه‌های مثبت در تست‌های چندگانه تحت تحلیل‌های مخصوص برای الل قرار گرفتند تا جهش هر کدام به طور خاص بررسی شود. DNA مرجع سرطان‌های انسانی اعم از G12A، G12C، G12D، G12R، G12S، G12V و G13D اختصاصی بودن تست را با =<۱٪ حساسیت الل‌های جهش‌یافته تأیید کردند. همچنین، کاربردی بودن تحلیل چندگانه‌ی جهش‌های KRAS با انجام آزمایش‌های جاسازی پارافین فیکس‌شده توسط فرمالین (FFPE) بر روی بیوپسی‌های سرطان روده‌ی بزرگ نشان داده شد. در نتیجه، تکثیر همزمان DNA جهش‌نیافته منجر به حذف داده‌های منفی کاذب از نمونه‌های تخریب‌شده می‌شود. همچنین، نتایج این روش مقرون‌به‌صرفه با نتایج حاصل از توالی‌یابی DNA در بافت‌های FFPE هم‌خوانی دارد، اما در حالتی که غلظت‌های DNA محدود هستند، حساسیت بالاتری دارد.
مقدمه
سرطان روده‌ی بزرگ سومین سرطان شایع در مردان و دومین سرطان شایع در زنانِ سراسر جهان است [۱]. کتاکسیمب و پانیتومامب آنتی‌بادی‌های مونوکلونالی هستند که در روش‌های بالینی برای درمان کارسینومای روده‌ی بزرگ، علیه گیرنده‌ی EGFR به کار می‌روند [۲]. جهش‌های سرطان‌زای KRAS مدت‌هاست که به عنوان مانع روش درمانی مذکور شناخته شده‌اند، چرا که منجر به تولید پروتئینی می‌شوند که همواره فعال است و به شکل مستقل از محرک، عملگردهای پایین‌دست EGFR، مانند آبشارهای RAF، MEK و ERK را فعال می‌کند [۳، ۴، ۵]. فعال‌سازی به وسیله‌ی فسفریلاسیون پروتئینی در چند تشکیل‌دهنده‌ی مسیرهای MAPK در نمونه‌های جهش‌یافته برای KRAS، ماندگارتر از دیگر گروه‌های توموری است. این فعال‌سازی‌های سرطان‌زا در نمونه‌های جهش‌یافته برای KRAS، در ۳۵ تا ۴۰ درصد از کارسینوماهای روده‌ی بزرگ دیده می‌شود و در بیشتر موارد، جهش در کدون ۱۲ (۸۰٪) و ۱۳ (۱۵٪) از اگزون ۲ رخ داده است [۶، ۷، ۸]. جهش در موقعیت‌های دیگر، برای مثال کدون ۶۱، ۱۱۷، ۱۴۶ و ۱۵۴ نیز دیده شده اما فراوانی بسیار کم‌تری (تنها حدود ۱٪) به خود اختصاص می‌دهد [۹، ۴]. آژانس پزشکی اروپا (EMA)، شبکه‌ی جامع ملی سرطان (NCCN)، انجمن سرطان‌شناسی بالینی آمریکا (ASCO) و اداره‌ی مواد غذایی و دارویی ایالات متحده‌ی آمریکا (FDA) توصیه می‌کنند که هدف قرار دادن EGFR به وسیله‌ی کتاکسیمب و پانیتومامب نیازمند این است که بیمار نسخه‌ی سالم و جهش‌نیافته‌ی KRAS را دارا باشد. بنابراین، غربال‌گری ساده و دقیق جهش‌های KRAS پیش از تیمار کردن با آنتی‌بادی علیه EGFR ضروری است [۲، ۱۰]. در موارد کمبود فراوانی DNA جهش‌یافته در مقایسه با طبیعی، تشخیص زودهنگام در بافت‌های دردسترس و موجود در کلینیک‌ها مشکل است. این امر نیاز به انجام تکنیک‌های مشکل، زمان‌بر و گران‌قیمتی برای ایزوله کردن سلول‌های توموری پیش از آنالیز مولکولی ایجاد می‌کند که برای آزمایش‌های پاتولوژیک رایج نامناسب است [۱۱]. از این رو، تشخیص و شناسایی الل‌های در اقلیت چالشی‌ست که به صحت و حساسیت تکنیک‌های مولکولی بستگی دارد و قادر است توانایی تشخیص جهش‌های کم‌یاب را پایین بیاورد.
تکنیک‌های مولکولی زیادی برای تشخیص جهش‌های KRAS ایجاد شده‌اند که هر کدام مزایا و مضرات متفاوت، هزینه‌های گوناگون و تفاوت‌های قابل توجهی در زمینه‌ی مدت آزمایش، اختصاصی بودن، حساسیت، توانایی تشخیص جهش‌های جدید، توانایی کوانتیده کردن الل‌های جهش‌یافته و تکرارپذیری نتایج دارند [۱۲، ۱۳، ۱۴]. در بین این روش‌ها، توالی‌یابی به روش سنگر کماکان استاندارد طلایی به شمار می‌رود؛ با این حال این روش حساسیت پایینی دارد و نیازمند بین ۱۰ تا ۳۰ درصد الل‌های KRAS جهش‌یافته از بین نمونه‌های طبیعی است [۱۲، ۱۵]. با توجه به این که PCR همه‌ی الل‌ها را با بازده برابر نسبت به غلظت‌های اولیه تکثیر می‌کند [۱۶]، روشی مطلوب برای کاش تکثیر الل‌های طبیعی است [۲، ۱۷]. PCR اختصاصی برای الل، که به عنوان سیستم تکثیری مقاوم در برابر جهش یا ARMS نیز شناخته می‌شود، بر این اصل استوار است که تکثیر در حالتی که باز آلی انتهای ۳’ در پرایمر با توالی الگو اتصال برقرار می‌کند، بازده بالایی دارد؛ در حالی که چنانچه این اتصال برقرار نشود و یا اتصال اشتباه برقرار شود، بازده پایین‌تر است [۱۸، ۱۹]. اختلاط روش‌های PCR اختصاصی برای الل و PCR زمان واقعی بر اساس کاوشگر‌های Taq-Man ابزار مناسبی برای ردیابی جهش‌ها با حساسیت و مقدار بالا به دست می‌دهد. تست‌هایی بر این اساس جهت استفاده در محیط بالینی ایجاد شده‌اند (۲۰-۲۵) و چند کیت آزمایشگاهی برای کاربردهای بالینی در بازار موجود هستند؛ برای مثال، کیت KRAS RGQ PCR ار تِراسکرین (کیاژن ) و کیت. [۲۱، ۲۲، ۲۵، ۲۶، ۲۷، ۲۸، ۲۹، ۳۰]
این مقاله در نشریه Plos منتشر شده و ترجمه آن با عنوان ردیابی چندگانه بهینه جهش در سایت ای ترجمه به صورت رایگان قابل دانلود می باشد. جهت دانلود رایگان مقاله فارسی و انگلیسی روی عنوان فارسی (آبی رنگ) کلیک نمایید.
منبع:
Optimized Multiplex Detection of 7 KRAS Mutations by Taqman Allele-Specific qPCR
